1.血清样品
1)轻轻将全血滴入洁净的离心管或用采血管采血(不能加抗凝剂)。
2)室温静置30分钟,4℃条件下,静置3~4小时,可见血块析出(也可放置 4℃冰箱过夜)。
3)4℃条件下,1900×g离心10分钟,可见淡黄色血清,取出上清后可再4℃条件下,3000×g离心10分钟,最大程度保证血清质量。
4)将血清冻存于-80℃。
5)干冰寄送样本。
提示:为保证实验结果,送样量最好4 mL 以上(大致需全血8-10mL)
注意:收集血清样本一定不要加入抗凝剂。
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2.细胞上清
1)细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间,贴壁细胞密度在70%-80%,悬浮细胞密度在60%-70%。
2)对于贴壁细胞,去除原有培养基,换为新的不含外泌体的培养基或者无血清培养基;对于悬浮细胞,300×g,4℃,10分钟收集细胞,使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基悬浮细胞并继续培养。
3)细胞继续培养24-48小时,根据细胞的生长速度确定收取上清的时间。
4)收集细胞上清,300×g,4℃,离心10分钟;小心吸取上清,注意避免吸入细胞或者细胞碎片。
5)3000×g,4℃,再次离心15分钟,确保将细胞或者细胞碎片去除干净。
6)取上清,注意避免吸入细胞或者细胞碎片(重要!),合并相同的细胞培液上清样品,装入无菌的玻璃瓶,可在4℃短期保存(1-2天),长期保存可冻存于-80℃。建议细胞上清分离后尽快进行外泌体分离,保存在4℃和-80℃都会对产量有一定的影响。
提示:送样量最好在15-20 ml 以上
注意:细胞培养基必须使用去除 exosome(de-exosome)的血清或者无血清培养基(例如Thermo Fisher的SFM)
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